严格厌氧微生物甲烷古菌分离纯化实验的改进

摘 要：目的：探索和改进分离纯化严格厌氧微生物甲烷古菌技术。方法：稀释滚管分离法。结果：对厌氧消化器中甲烷菌进行富集、多次稀释滚管分离获得甲烷菌纯培养。结论：稀释滚管分离培养技术方法可靠，分离的效果好，适用于各种严格厌氧微生物的分离纯化。

关键词：甲烷古菌； Hungate除氧系统； 富集； 滚管分离； 纯培养

中图分类号：Q939文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）04-170-003

厌氧微生物的分离是黔南民族师范学院微生物课程开放性实验项目之一。目前国内高校多数实验室对严格厌氧菌分离纯化主要采用焦性没食子酸法、厌养罐法、厌养培养箱法等[1]。焦性没食子酸法进行厌养菌分离培养,由于其方法简单，操作容易,在大专院校微生物实验教学中仍广泛使用,但操作过程厌氧条件不易控制，特别是对严格厌氧的甲烷古菌分离效果差。厌养罐法能够为厌氧菌生长提供严格厌氧的环境，但不能为整个分离纯化操作过程提供厌氧环境，使用受到限制。厌养培养箱法虽然能为厌氧菌分离培养提供严格厌氧环境，需要特制设备,在厌氧箱中操作也不方便，由于价格昂贵，因而其应用受到一定限制。为此，为了改进厌氧细菌的分离纯化方法，结合对厌氧消化器中甲烷古菌的分离与纯化开放性实验，借助Hungate除氧系统进行稀释滚管分离，收到了很好的效果，现将有关技术介绍如下。

一、材料用具

1.接种物

取自黔南民族师范学院微生物实验室厌氧发酵缸（厌氧消化器）底部的沉积物。

2.仪器用具

2.1Hungate除氧系统。Hungate除氧系统由高纯氢气、高纯氮气，铜柱，加热套，不锈钢分支管，橡皮胶管，注射器及9号针头等组成。铜柱结构直径30～50mm、长300～500mm的石英玻璃管，两端加工成漏斗状，便于连接胶管，玻璃管中装入碎铜丝（长10～20mm，直径0.5mm），压紧，铜丝下面垫上玻璃纤维以防止碎铜丝散落，上端留出50mm左右的空间。铜柱外缠绕加热带，铜柱顶端用胶管与具有分支的不锈钢通气总管连接。不锈钢总管下的各分支管用橡皮胶管连接，橡皮胶管的另一端连接1mL塑料质注射器，注射器再与9号针头连接（图1）。

图1Hungate厌氧操作系统示意图

2.2其它器具。高压灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜，厌氧管（16×160mm），厌氧瓶（100mL），光波炉，3000 mL三角瓶，各种规格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.获取无氧N2、H2、CO2气体

甲烷菌是严格厌氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分离甲烷菌都用H2和CO2作为营养。其分离过程需要人工保持一个无氧环境进行操作和供其生长繁殖。用于分离严格厌氧微生物使用的气体虽然是高纯气体（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate铜柱除氧系统可除掉这些微量的O2，提供和保持无氧环境。

2.铜柱除氧与还原

铜柱除氧原理：实验使用的高纯气体（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，当气体经过铜柱时，这些气体中的微量O2与Cu反应生成CuO（O2＋Cu→CuO），从而流出铜柱的气体则为无O2气体。

铜柱还原：铜柱使用后，里边的Cu被氧化为CuO不能继续与O2发生化合反应，失去除氧能力。此时，关掉其它气体，通入H2，同时使铜柱升温（达350℃），当H2通过高温铜柱时，铜柱内CuO与H2反应（CuO＋H2→Cu＋H2O）生成单质Cu，CuO在加热条件下（350℃）被H2还原为Cu，铜柱恢复除氧能力可反复使用。

操作步骤：打开Hungate铜柱除氧系统通气橡皮管的通气开关（止水夹），开启H2钢瓶，H2气流通过铜柱，从铜柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此时接通电热套电源，铜柱升温，温度达到350℃左右，20～30min后，铜柱内的碎铜丝被H2还原，由黄黑色变为纯铜铮亮色，当铜柱里面的水蒸气被排出完全后，关闭H2钢瓶，铜柱还原结束。

3.获取无氧N2、H2和CO2气体

无氧N2用于厌氧菌分离操作和培养过程中驱赶空气，保证局部无氧环境。在铜柱还原结束后，立即打开N2钢瓶，气流大小控制以针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意控制气流的大小。此时铜柱内的碎铜丝处于还原状态的单质铜，当通入高纯N2（99.999%）时，其中所含的极微量氧与单质铜反应，氧被固定下来（形成CuO），流出铜柱的则是无氧N2。利用无氧N2气流驱赶厌氧管、血清瓶等培养容器和培养基中的空气，以及挑菌时保证无氧环境。使用完毕后，先关紧N2钢瓶，接着用止水夹封闭所有橡皮管。无氧H2、CO2的获取方法操作步骤相同。

2.制备无氧培养基

2.1培养基配方（详见表1）

表1培养基配方表[2]

注：微量元素溶液配制时先溶解氨三乙酸，NaOH调pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后调pH于7.0。

3.制备方法

按照配方称取药品置于事先放有适量蒸馏水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的盐酸半胱氨酸，用NaOH调节pH值，加足需要水量，用记号笔在三角瓶外壁标上记号，加入一定量的蒸馏水作蒸发量后，置于光波炉加热煮沸10min后，通入无氧N2（驱赶空气，保持培养基为无氧状态）煮沸至培养基颜色变白后再煮10min左右进行分装。用9号针头连接的橡皮管，将无氧N2引入待装培养基的厌氧管和厌氧瓶（16×160mm厌氧管、100mL厌氧瓶）洗管、瓶（用无氧N2换出瓶中空气，使容器中无氧分子存在），用培养基分液器进行分装，厌氧管装4.5mL，厌氧瓶装45mL，待装好培养基后取出N2管塞上橡胶塞，旋紧盖子。转好培养基的厌氧试管用专用布袋装好与厌氧瓶一起置121℃，0.1MPa灭菌20min待用。（厌氧瓶内的培养基使用前加入无菌无氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厌氧管内培养基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水样取样器取沼气底泥5克于上述装有45mL培养基的厌氧瓶中，利用Hungate厌氧系统，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H280mL、CO220mL，置30℃恒温培养30天，用化学吸收法[3]检测厌氧瓶是否有甲烷气体产生，在甲烷菌生长对数增长中期，从产甲烷气体的富集瓶中取样进行滚管分离。

5.滚管分离和纯化培养

5.1滚管分离培养。对检测有甲烷菌存在的富集处理，进行第1次滚管分离。在分离培养基中补加琼脂粉（20g/L），分装于厌氧试管（16 mm×160mm，4.5mL培养基/管），灭菌。灭菌后置55℃水浴中保持液态，每支厌氧管中分别加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL无菌无氧注射器取富集的样品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀释，重复3次，每支试管上下倒2～3次（注意不要产生气泡），使样品与培养基充分混匀并立即将稀释管置于装有4℃以下冰水的磁盘中迅速滚管，使培养基与样品均匀光滑无气泡凝固于管壁上。

将滚管分离样品的厌氧管置于试管架上，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。对有甲烷气体产生的管子，置于荧光显微镜下观察菌落，对有荧光反应的菌落用记号笔画圈作出记号，待进一步分离培养。

5.2甲烷菌纯化。纯化过程是多次挑取单菌落、稀释滚管培养的过程。截取细玻璃管（内径0.5cm、外径0.8cm，长15cm），两端塞上脱脂棉，在酒精灯的火焰上加热并拉成毛细管，高温灭菌并烘干。在无氧条件下挑菌：将有荧光反应菌落的管子置于铁架台上固定，打开管口，用无氧N2吹入管中，使管内保持无氧状态。取毛细管一端与橡胶管连接（橡胶管一端用夹子封住，含在口中），另一端（2mm左右处）在酒精灯火焰上加热并使之弯成约90℃，用它的弯头接触到有荧光记号的菌落，轻吸一口气，使菌落进入毛细管，移出毛细管并快速放入有4.5mL培养基的无氧管子中，迅速塞上胶塞的同时折断毛细管并旋上外盖。按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。

通过单菌落分离获取的菌液经培养后底部有沉淀出现，用吸收法检测管中有无甲烷气体产生。对有甲烷气体的菌管，用上述方法再进行2次滚管分离，则可获得甲烷菌的纯培养。挑取纯培养菌落进行液体培养30d后，置4℃条件下进行保藏，同时进行鉴定。

6.甲烷菌鉴定

6.1菌落荧光反应检测。利用产甲烷古菌在特定波长（420nm）激发下能产生特有的蓝绿荧光，对分离到的样品管进行菌落荧光反应检测，有荧光反应的样品管证明其有甲烷菌存在。

6.2产甲烷气体检测。利用甲烷菌能产生甲烷气体的特性，将有荧光反应的样品管用气相色谱仪或化学吸收法进行产甲烷气体检测，有甲烷气体产生的样品管，再一次证明样品中有甲烷菌存在。

6.3产甲烷菌纯度检测。用1mL注射器抽取有荧光反应的样品液置荧光显微镜下观察，菌体有荧光产生，物气体杂菌，则为甲烷菌纯菌，并将置常温冰箱4℃保藏，待进一步研究或应用。

三、结果与小结

1.结果

1.1利用稀释滚管分离法从厌氧消化器中分离获得99支甲烷古菌纯培养，经产甲烷气体和荧光反应鉴定证明是甲烷菌（图2）。

甲烷杆菌属甲烷短杆菌属甲烷球菌属甲烷微球菌属

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

图2采用稀释滚管分离纯化法得到的甲烷菌图片

1.2甲烷菌分离纯化技术流程

经上述试验，归纳建立甲烷菌分离纯化技术，其流程如下：

第一次滚管分离

第二次滚管分离

第三次滚管分离

1.3小结

采用Hungate厌氧操作系统清除氧气彻底，操作过程能及时发现和控制无氧环境。培养基中加入对氧气敏感的刃天青指示剂，能及时观察操作过程的无氧状态，使整个操作过程和培养都在无氧状态，满足严格厌氧的要求。建立的稀释滚管分离法操作简便、利用荧光显微镜观察，菌落易于辨认，易挑取，操作过程不易污染，分离效率高等优点。只要满足厌氧微生物的营养需求，样品中的厌氧微生物都能分离出来。

基金项目：黔教高发[2012]426号；黔南民族师范学院微生物学重点学科[2011.6]；黔南民族师范学院教学质量工程项目院教发[2011]5号。

参考文献：

[1]庞德公,杨红建.产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用[J]中国畜牧兽医,2010，37(6)：32—35

[2]赵一章.产甲烷细菌及研究方法[M]成都科技大学出版社，1997182-199

[3]赵洪,邓功成,高礼安,等.农村沼气主要成分简易快速测定方法[J]安徽农业科学,2008，36（20）：8766～8767