土壤中金黄色葡萄球菌分离实验改进

摘 要：目的：从土壤中分离金黄色葡萄球菌。方法：选择性培养基平板涂布分离法。结果：分离到的菌株经菌落鉴定、革兰氏染色和形态鉴定以及金黄色葡萄球菌测试卡鉴定，都符合金黄色葡萄球菌特征。结论：所采用从土壤中分离微生物的方法快速，简便，可靠，可在教学中推广应用。

关键词：金黄色葡萄球菌； 分离； 实验改进

中图分类号：R378.11 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）10-165-001

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛分布于自然界，土壤、空气、水体、尘埃、人和动物的身体表面都可找到。因而由它引起食品污染的机会很多。可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位，偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等，是医院感染常见的病原体之一。金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多[1]。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌[2]。

金黄色葡萄球菌在平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径一般为1～2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。典型的金黄色葡萄球菌个体形态为球型，直径为0.5～1μm，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、无鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。它对营养要求不高，在普通牛肉膏培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适宜生长温度37℃，最适宜生长pH7.4，干燥环境下可存活数周。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可以在10%～15%NaCl肉汤中生长。对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。为控制金黄色葡萄球菌对人类的危害以及在生物教学中常常要分离其菌株对其进行研究。传统的分离方法需要对菌落多次纯化，实验麻烦。因而探索快速可靠的分离方法，获得金黄色葡萄球菌在实际工作中有积极意义。

一、材料

（一）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（13%NaCl）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠130g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min后倒平板。

（二）试剂

复方磺胺甲恶唑，革兰氏染液，甲苯胺兰-DNA，金黄色葡萄球菌测试卡（广州绿洲生化科技股份有限公司出品）。

二、方法

（一）金黄色葡萄球菌的分离

称取10g土样，在无菌条件下放入灭菌的三角瓶中，加入90mL蒸馏水，再加入0.2mg复方磺胺甲恶唑振荡10min，使土样充分混匀，利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性，杀死其它细菌。从三角瓶中取1mL上清液放入一支无菌试管（15×150mm）中，按10倍梯度稀释法稀释成10-5的土壤稀释液后，分别取200μL涂布于牛肉膏蛋白胨高盐培养基平板上，置于37℃培养箱中恒温培养24h。利用高盐培养基抑制其它细菌的生长，从而分离得到金黄色葡萄球菌。

（二）金黄色葡萄球菌的鉴定

1.菌落形态。菌落较小，圆形、直径1～2㎜，较湿，较透明，边缘整齐，隆起，略带淡绿色。

2.染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈单个或葡萄状排列、无芽孢、荚膜，单个菌体直径为0.5～1μm。

3.金黄色葡萄球菌快速测试片鉴定。该测试片含有选择性培养基（改良的Baird-Parker营养物及冷水可溶的胶体）和专一性的酶显色剂，即热稳定核酸酶（Tnase）反应片，包含有甲苯胺蓝（toluidineblue-O） -DNA及四唑指示剂（tetrazolium），此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌热稳定核酸酶的存在。使用该测试片培养15～24h就可确认是否有金黄色葡萄球菌的存在。操作方法按测试片使用说明书进行。

（1）样品处理。用无菌接种环取待测菌落一个放入含有2mL无菌水的试管中，适当振荡均匀，制成样品液（记录菌落特征并编号）。

（2）接种。将金黄色葡萄球菌快速测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌注射器或吸管吸取1mL样品液慢慢均匀地滴加到金黄色葡萄球菌快速检测片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置5min，使培养基凝固，最后用手轻轻地压一下。

（3）培养及结果判定。将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。37℃，培养15～24h，观察结果。测试片上紫红色的菌落为金黄色葡萄球菌。

（4）注意事项。

①在环境温度20～30℃下操作；检测卡极易受潮，打开小包装后应立即使用。②所有跟待检样品接触的器具都应灭菌，或一次性灭菌器具。③样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时用1mol/LNaOH或1mol/L HCl调节pH。

三、小结与讨论

利用金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，对磺胺类药物有敏感性低的特性，制备选择性培养基，采用平板涂布法分离到的菌株，经菌落特征鉴定、革兰氏染色显微镜形态观察鉴定以及金黄色葡萄球菌测试卡鉴定，都符合金黄色葡萄球菌特征。所采用从土壤中分离金黄色葡萄球菌的方法快速，简便，可靠，可在教学和实际工作中推广应用。

基金项目：贵州省高校专业综合改革试点项目：黔教高发[2012]426号；黔南民族师范学院微生物学重点学科建设项目：院政发[2011]04号；黔南民族师范学院优秀教学团队建设项目，院教发{2011}5号。

参考文献：

[1]刘旭伟，葛文霞.金色葡萄球菌肠毒素[J]微生物学杂志，2008，28（5）：86～89

[2]高涛.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展[J]福建分析测试，2003，12（2）：1775～1778