“神剪手”CRISPR-Cas9的原理与应用

人类拥有自己的免疫系统，当病毒或者其它有害的物质入侵机体后，自身的免疫系统就会发挥作用，通过天然免疫和适应性免疫保证机体的健康。细菌亦是如此，也会被病毒入侵，它的体内也有自己的防御系统，即CRISPR-Cas系统，它是细菌进化过程中的获得性免疫防御机制，相当于人体的特异性免疫。自从该系统被发现，许多科学家团队不断地苦心研究，诞生了一项名为CRISPR-Cas9的基因编辑技术。下面让我们来共同了解一下这一技术。

CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。CRISPR主要由前导序列、重复序列和间隔序列构成。

CRISPR是指成簇的规律间断的短回文重复序列，存在于DNA中的特定区域，包含基因组靶向序列和核苷酸重复序列。这两种序列之间交替排列，形成了细菌免疫系统的一部分。CRISPR相当于一个资料库，用来储存病毒的资料，其中靶向序列可以储存病毒的DNA序列，重复序列可以充当隔板，将不同病毒的资料分隔开来。当再次遭遇相同的病毒入侵时，细菌便可以迅速识别并且破坏其DNA，起到“免疫”的效果。

CRISPR如果想要完全杀死病毒，还需要依靠整个CRISPR-Cas系统。该系统的前导区是CRISPR序列的启动子，它的前端是Cas基因家族。Cas基因编码的蛋白被称为Cas蛋白。由于Cas蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，Cas基因被命名为CRISPR关联基因。Cas蛋白它们充当着剪刀的角色，每当有病毒入侵的时候，它们就会出动，切割病毒的DNA片段并将其带回资料库中储存起来。根据Cas蛋白的相关作用，目前可以将CRISPR-Cas系统分为三大类，Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，其对应的蛋白分别为Cas3、Cas9和Cas10蛋白，其中CRISPR-Cas9系统被应用的最多。

CRISPR-Cas9的作用机理可以大致分为三个阶段：当病毒首次侵入时，相关的Cas蛋白对外源DNA片段进行选择，通过识别原间隔序列临近基序PAM区域切割下来一段特殊的DNA序列作为原间隔序列，并且在酶的作用下将该序列插入CRISPR序列前导区的下游，从而对该病毒的“身份”进行储存。接着，CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA，并且与反式激活crRNA（tracrRNA）形成双链RNA。这一双链RNA与Cas9蛋白结合，在酶的作用下，将与入侵病毒类型对应的间隔序列RNA切割下来，形成了crRNA。最后，crRNA、tracrRNA以及Cas9蛋白形成复合物。当外源DNA出现时，这一复合物就会“监视”整个序列，当发现了与crRNA互补的原间隔序列时，就会立刻进行定位，将外源DNA解螺旋。与此同时，Cas9蛋白“闪亮登场”，对DNA双链进行了“消灭”处理。

借助CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas9基因编辑技术被广泛应用于基因敲除和基因敲入等。该编辑技术主要包含两个环节：切割环节和修复环节。切割环节是通过人工的设计，将tracrRNA和crRNA融合为sgRNA，它们发挥着向导的作用，Cas9蛋白通过PAM到达靶点上游，将DNA的双链解螺旋，与此同时，对DNA进行切割，使其双链断裂。DNA双链断裂激活了DNA修复机制，就进入了修复环节，即通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）的方式修复基因组DNA。NHEJ通过插入或者敲除几个碱基，快速地将断裂的DNA连接起来，很容易使切割位点发生移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除；HDR模式则实现了精准编辑，通过将DNA修复模板导入细胞，基因组断裂部分就依据修复模板进行同源重组修复（HDR），从而实现基因敲入。除此之外，CRISPR-Cas9基因编辑技术还被用于基因抑制、基因激活、多重编辑、功能基因组筛选等。

然而，CRISPR-Cas9技术也存在一些挑战和局限性，包括脱靶效应（即Cas9在非目标位点切割DNA）、编辑效率和特异性的优化、以及在某些细胞类型和组织中的递送问题。我们期待在未来能够有更安全、有效、精准的基因编辑技术的诞生。